현미경 대물렌즈의 이해

현미경 검사(microscopy)는 인간의 눈으로 구분할 수 없는 표본을 관찰할 수 있도록 한다. 이러한 현미경 검사법은 일반적으로 광학, 전자, 물리적 주사 탐침(scanning probe) 현미경과 같이 세 가지 분야로 나뉠 수 있다. 기사에서 중점 적으로 다루는 광학 현미경은 회절 및 굴절과 같은 광학적 특성에 큰 영향을 받는다.

더 나아가 광학 현미경은 명시야, 암시야, 위상차(phase contrast), 미분간섭(DIC), 형광, 공초점 기반의 시스템과 같이 여러 가지 기술에 따라 세분화 된다. 각 기술 간에는 유사점과 차이점이 많기 때문에 시스템에 적용되는 대물렌즈의 유형을 알아야만 이같은 차이점의 상당 부분을 파악할 수 있다.

<그림1> 무한 보정 대물렌즈의 기본 구성                      <그림2> Apochromatic (위) 대 Achromatic (아래) 대물렌즈의 디자인

대물렌즈의 유형

현미경 대물렌즈는 일반적으로 유한과 무한(무한 보정) 같이 크게 두 가지 범주로 나뉠 수 있다.

유한 공액 광학 디자인에서 광원으로부터 방출되는 빛 (무한대가 아님)은 한 점에 집중적으로 모이게 된다. 현미경으로 관찰 시 검사 대상 피사체의 이미지는 배율 확대를 거친 뒤 접안렌즈에 투사되거나 카메라를 사용할 경우 센서에 투사된다. 시스템 내에서의 특정 거리는 DIN 또는 JIS 표준에 따라 규정 된다. 모든 유한 공액 현미경은 이들 두 가지 표준 중 하나에 속한다.

일반적인 검사나 조립 목적으로 사용되는 시스템을 포함해 기본적인 현미경에는 대부분 이런 종류의 대물렌즈가 사용된다. 유한 공액 디자인은 비용 및 사용 편의성이 중요시되는 용도에 적용하기 적합하며, 유한 공액 대물렌즈는 주로 명시야 기술용으로만 사용된다.

무한 공액 또는 무한 보정 광학 디자인에서 무한대에 배치된 광원으로부터 방출되는 빛은 작은 점에 집중된다(그림1). 대물렌즈에서 이 스폿은 검사 대상 피사체이자 접안렌즈를 향하는 무한 지점으로서 카메라를 사용할 경우 센서를 향한다. 이러한 유형의 현대적 디자인에서는 이미지 생성을 위해 피사체와 접안렌즈 사이에 별도의 튜브렌즈를 활용한다.

이 디자인은 유한 공액 디자인에 비해 훨씬 복잡하긴 하지만 필터, 폴라라이저, 빔스플리터와 같은 광학 구성 요소를 광학 경로에 삽입할수 있도록 한다. 형광 현미경에 일반적으로 적용되는 디자인이 바로 무한 공액이다. 무한 보정 대물렌즈는 평탄도, 색수차, 구면 수차, 편광 등과 같은 광학적 오류를 보정하기 위해 대개 다중 요소 디자인을 채택한다.

시스템의 수행 능력은 대물렌즈와 접안렌즈의 특성에 의해 결정된다. 특히 사용하고자 하는 대물렌즈의 유형을 선택 시에는 품질 보정력을 자세히 살펴봐야 한다. 품질 보정 력은 대물렌즈에 주로 표시되어 있어 대물렌즈의 디자인을 손쉽게 확인할 수 있다.

일반적으로 색수차 및 구면 수차 보정은 achromatic, fluorite, apochromatic과 같이 세 가지 단계로 나뉜다 (apochromatic과 achromatic은 그림2 참조).

Achromat 대물렌즈는 가장 단순하면서도 최저가인 대물렌즈 유형이다. 색수차 보정은 적색 및 청색 파장에서 이루어지며, 구면 수차 보정은 녹색 파장에서 이루어진다. 이 대물렌즈는 보정력에 한계가 있어 일반 용도 및 단색 용도 에서 사용하기 적합하다.

Fluorite(또는 Fluor) 대물렌즈는 광물질인 형석을 함유한 고급 글래스 타입을 이용해 제조되며, 종종 대물렌즈 명칭에 합성 물질 이름이 대신 들어가기도 한다. Fluorite 대물렌즈 제조에는 여러 유형의 글래스가 사용되어 최소 두가지 컬러에 대한 색수차와 구면 수차를 보정할 수 있다. 또한 Achromat 대물렌즈보다 더 높은 개구수(NA)와 해상력을 가지고 있어 컬러 이미징 용도에서 더 밝은 이미지와 향상된 콘트라스트를 생성한다.

Apochromat 대물렌즈는 가장 높은 수준의 보정력을 제공한다. 색수차 보정은 최소 3개 컬러(적색, 청색, 녹색)에 대해 이루어지고, 구면 수차 보정은 최소 2~3개의 컬러에 대해 이루어짐에 따라 백색광 용도에 사용하기 적합하다.

이 대물렌즈는 더욱 길어진 작동 거리(WD)와 가장 높은 개구수(NA)를 갖는 경향이 있다. 보다 최근에 선보이는 고성능 Fluorite 및 Apochromat 대물렌즈 중 대다수는 더 높은 보정력을 가지고 있어 색수차의 경우 4개 이상의 컬러, 구면 수차의 경우 4개 컬러에 대한 보정이 가능하다. 하지만 위에서 언급한 세 가지 대물렌즈 모두 왜곡과 상면만곡과 같은 문제점을 가지고 있어 배율 증가 시 더 많은 어려움을 겪을 수 있다.

상면만곡(Field curvature)은 평평한 이미지 면에서 비축 이미지(off-axis image)가 초점을 맺지 못할 때 나타나는 광수차의 일종으로서 광축에서의 이탈로 인해 이미지가 흐릿해지는 현상을 일으킨다. 이러한 상면만곡을 보정하기 위해서는 plan(혹은 planar) 및 semi-plan(혹은 semi-planar 및 microplan)과 같이 품질을 두 가지 수준으로 지정한다.

상면만곡 보정력이 없는 대물렌즈는 이미지 중심 부에서 65%의 평평한 시야를 갖는다. 이에 반해 Semi-plan 대물렌즈는 80%의 평평한 시야를 갖는다. Plan 대물렌즈는 최상의 보정력을 제공하는 대물렌즈로서 초점을 맺은 상태에서 90%가 넘는 평평한 시야를 제공한다.

<그림3> 7개의 부품으로 구성된 무한 보정 이미징 현미경 시스템

튜브 렌즈를 무한 보정 대물렌즈와 사용하기
 

무한 보정 대물렌즈와 튜브 렌즈 사이의 거리(L)는 권장되는 거리나 최적의 거리에 따라 달라지며, 이미지 필드의 직경(Ø)에 영향을 미친다.

<공식1>과 <공식2>는 Ø와 L의 상관관계를 구하는 근사 공식이다.

예시: M Plan APO 10X 대물렌즈 (#46-144), MT-1 튜브 렌즈 (#54-774) 및 2/3” 센서 카메라를 이용해 비네팅 현상 없이 튜브 렌즈와 대물렌즈 사이에 생기는 공간의 최대치는? 대물렌즈의 초점 거리 (F1)는 20mm이고 NA는 0.28일 경우, 출사 동공 직경의 계산은 다음과 같다.

2/3” 이미지 센서는 대각선의 길이가 11mm이기 때문에 때문에 Ø는 최소 11mm이어야 한다. MT-1 튜브 렌즈의 초점 거리는 200mm이고 입사 동공 직경은 24mm이다. 따라서, L은 다음과 같이 계산된다.

단, 튜브 렌즈와 대물렌즈 사이의 공간이 232.7mm 이하가 될 때비네팅 현상이 발생하지 않는다.

현미경용 형광 필터
 

형광 현미경 검사법은 흡수, 산란, 반사 대신 형광단(fluorophore) 을 사용해 유도되는 형광 현상을 활용하는 광학 현미경 검사 기술이다. 형광단은 형광 염료의 일종으로서 형광 현미경 검사를 위해 단백질, 조직, 세포에 형광 레이블을 표시하는 데 사용된다. 형광단은 흔히 여기 범위라 불리는 특정 파장 영역의 에너지를 흡수하고, 일반적으로 방출 범위라고 불리는 다른 특정 파장 영역에서 흡수된 에너지를 다시 방출하는 방식으로 형광 효과를 낸다.

<그림4> 형광 현미경의 기본 구성

형광 현미경 시스템은 에피플루오레슨트 현미경과 같이 아주 단순한 것부터 공초점 또는 다광자 시스템과 같은 아주 복잡한 것까지 종류가 매우 다양하다. 단순하든 복잡하든 간에 형광 현미경은 여기 에너지(excitation energy)를 사용해 표본을 조명 하면, 표본에서는 비록 약하지만 정량화할 수 있는 방출 에너지 (emission energy)가 생성된다는 기본 개념을 공유한다. 여기및 방출 파장은 중심 파장이 동일하지 않기 때문에 특수 광학 필터를 이용해 전체 콘트라스트 및 시그널을 증가시킬 수 있다.

<그림4>에서는 가장 기본적인 개념과 도식을 확인할 수 있다.

필터 조합은 3개의 특수 필터(여기 필터, 다이크로익 필터, 방출 필터)로 구성된다. 여기 필터는 형광 시스템의 조명 경로 내에 배치되며 검사 대상 형광단 또는 견본의 여기 범위를 제외한 광원의 모든 파장을 걸러낸다. 다이크로익 필터는 여기 필터와 방출 필터 사이에 45° 각도로 배치되며 여기 신호는 검사 대상 형광단 쪽으로 반사하고 방출 신호는 디텍터 쪽으로 투과시킨다. 방출 필터는 형광 현미경의 이미징 경로 내에 배치되며 검사 대상 형광단의 전체 여기 범위를 걸러내고 방출 범위는 투과시킨다.

<그림5> 일반적인 여기 및 방출 프로파일

대표적인 여기 및 방출 프로파일은 <그림5>와 같다. 이 그림에 서는 흡수 및 방출 프로파일이 동일한 파장을 공유한다는 것을 명확히 알 수 있는데 이는 높은 투과율, 좁은 대역폭, 높은 광학 밀도, 극히 뚜렷한 Cut-On 및 Cut-Off 대역을 갖는 고품질 필터가 필요한 이유를 설명해준다. 저품질 필터를 사용하면 궁극적으로 표본이나 견본, 또는 값비싼 센서의 손상으로 이어질 수 있다.

개구수(NA)가 성능을 보장하지 못하는 이유

개구수(NA)는 고정 작동 거리에서 빛을 모으는 대물렌즈의 성능을 설명하기 때문에 현미경 대물렌즈를 규정할 때 중요한 사양이다. 보통 개구수가 대물렌즈의 해상력을 설명한다고 생각하지만, 정확한 가정이라고 할 수 없다. <공식3>은 개구수를 계산하는 데 사용되는 1차 방정식이다.

이는 정축 (on-axis) 개구수를 이해하는 데 도움이 되지만 비축(offaxis) 성능의 필드 변화는 고려하지 않은 방정식이다. 또한, 현미경 대물렌즈 제조 및 조립 과정에서의 공차가 성능에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려하지 않았다.

<그림6> 1.1" 센서에 USAF Resolution Test Target을 사용하여 콘트라스트를 비교하는 이미지. a) 5배율 120i Plan APO Infinity Corrected Objective 사용 시 330lp/mm에서 콘트라스트가 20%, b) 5배율 Plan APO infinity Corrected Objective 사용 시 330lp/ mm에서 콘트라스트가 10%

<그림6>은 개구수가 0.14로 동일한 5배율 120i Plan APO Infinity Corrected Objective와 5배율 Plan APO Infinity Corrected Objective의 비축 성능을 비교한 그림 이다. 1.1” 센서의 모서리 부분에 120i Plan APO Infinity Corrected Objective를 사용했을 때 비축 성능이 더 우수하며, 이는 개구수가 대물렌즈의 성능을 결정하는 요소가 아님을 보여준다.

자료제공: 에드몬드옵틱스(www.edmundoptics.co.kr)